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单细胞RNA测序
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胚胎发育
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人类胚胎发育早期仅能收集微量的胚胎细胞和干细胞，这对于了解控制胚胎发育的基因调控网络是一个难题，利用单细胞RNA-Seq技术对转录组进行分析则克服了转录组分析对细胞数量要求的限制，近年来已有多篇相关报道。北京大学汤富酬教授课题组早在2009年就对单个小鼠卵裂球的进行RNA-Seq[4]，检测到了比微阵列技术多75%（5270）的表达基因，并且确定了1753个新的可变剪接位点。这种单细胞mRNA- Seq检测将大大提高我们对单个细胞在哺乳动物发展中转录复杂性的分析能力， 尤其是胚胎发育早期和干细胞这类在体内罕见的细胞群。2013年，他们又对90个处于不同发育阶段的人类早期胚胎细胞以及34个胚胎干细胞进行了详尽的分析[5]，检测出了22,687个母源表达基因，其中包括8,701条长链非编码RNAs，相比于以往通过microarray检测出的9,735个母源基因数量大大增加。研究还发现了2,733条新的lncRNAs，其中许多只在特定的发育阶段表达。此外，实验还检测到1498个基因在上胚层（Epiblast，EPI）和体外人类胚胎干细胞间存在差异表达，证实了EPI和ESCs具有显著不同的转录组，有显示差异性表达，从而解答了人类上胚层和体外干细胞之间的基因表达是否相同这一由来已久的问题。
早期胚胎的单细胞测序
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器官发育
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发育是一个极其复杂的过程，器官发生涉及到多种细胞类型的协调作用，期间基因表达受到严密、精准的调控，这一过程中的基因表达调控机制仍然亟需深入研究。心脏是哺乳动物在胚胎期最先形成的功能器官之一。尽管已有对小鼠胚胎心脏发育的大量系统研究，但是人类与小鼠的心脏存在着很大差异。2019年，汤富酬课题组和乔杰课题组合作，利用高精度单细胞转录组测序技术对人类胚胎5周至25周心脏的4000多个单细胞进行了系统的分析[6]。该研究系统鉴定了人类胚胎期心脏的主要细胞类型，包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、瓣膜细胞、心外膜细胞、平滑肌细胞以及各种免疫细胞（包括肥大细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞）。随着心脏发育进展，心房、心室中的心肌细胞比例显著下降，成纤维细胞、巨噬细胞等非心肌细胞的比例逐渐上升，这说明在发育过程中成纤维细胞等非心肌类型细胞对心脏发育的作用可能越来越重要。此外，还发现心肌细胞解剖位置特异性的基因表达特点，而这些特点在早至胚胎发育第5周时就已经有明确显现。此外，通过与已经发表的小鼠心脏发育的单细胞转录组数据进行系统比较，鉴定出一系列人类心脏发育过程中主要细胞类型特异表达的重要基因。该研究还发现人类与小鼠的心脏中心肌细胞是最为相似的细胞类型，而成纤维细胞等细胞类型的物种间差异较大，这为利用小鼠模型研究人类的心脏发育提供了参比标准。
心脏发育过程中主要细胞类型的时空特征
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干细胞分化
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造血干细胞（HSC）具有长期自我更新、分化成多种成熟血细胞的潜能。它起源于胚胎前体，包括生血内皮细胞和造血干细胞前体（pre-HSCs）。2016年，军事医学科学院刘兵课题组利用pre-HSCs特异性的表面标志，分离出高纯度的pre-HSCs。并针对HSC发育过程中具有代表性的5类细胞进行单细胞转录组测序，绘制了HSC发育过程的转录组图谱，揭示了pre-HSC在转录活性、基因表达、代谢状态、信号通路和转录因子网络等方面的特征[7]。发现并揭示mTOR信号通路在特异性调控HSC发育中发挥了关键作用。此外，还发掘出Pre-HSC的98个特征基因。该研究为今后阐明HSC的体内发育规律、发掘HSC的体外再生策略提供了可靠的理论依据和数据资源。基于以上单细胞转录组数据，课题组在2019年进一步描绘出HSC发育全程的lncRNA动态表达图谱，并鉴定到在HSC发育过程中重要的功能性lncRNA分子[8]。本研究通过生物信息学分析筛选获得一组潜在的功能性lncRNA，并通过体外功能实验发现6个可能在胚胎造血发育中发挥作用的lncRNA。利用条件基因敲除研究策略，着重阐明了lncRNA-H19对于AGM区HSC发生的重要作用。LncRNA-H19的缺失使得重要造血转录因子（包括Runx1及Spi1等）的启动子区域高甲基化并下调其表达，以致血管内皮细胞向pre-HSC的转化阻滞。
HSC发育过程中的基因动态图谱
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神经科学
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神经科学是单细胞测序的另一个应用领域，哺乳动物的大脑中有数十亿个神经元，每个神经元可根据形态特征，电生理特性，分子标记进行归类。在一群细胞中，单个神经元特异性的信息就被稀释了，少数细胞特异的基因表达则有可能无法检测到。研究不同神经元的表达模式能够为我们提供更全面的基因表达图谱、甚至表达调控网络。而且，将单个神经元的基因表达于神经元的表型信息结合起来，还能帮助我们对神经元进行更加准确和细致的分类。上海伯豪助力中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所张旭院士研究组，通过高覆盖度的单细胞测序和以神经元大小为参考的层次聚类，对小鼠背根神经节初级感觉神经元进行了分类，又通过全细胞膜片钳在体记录结合单细胞PCR方法可检测各类初级感觉神经元对外周皮肤刺激的反应。该工作首次通过高覆盖的单细胞测序对初级感觉神经元进行了重新分类，并且建立了基因表达与在体功能的相互关系[9]。
神经元单细胞测序及亚群分类
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肿瘤微环境
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肿瘤细胞能够采用不同策略，使人体的免疫系统受到抑制，不能正常杀伤肿瘤细胞，上述过程被称为免疫逃逸。免疫治疗通过激活人体自身的免疫系统，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤。其中抗程序性死亡蛋白1（programmed death 1, PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂是目前研究最多，发展最快的一种免疫疗法。在各种肿瘤中，接受PD-1 /PD-L1抑制剂单药治疗患者的客观有效率也仅为10-30%，大部分患者对免疫检查抑制剂并不敏感。随着研究的深入，人们逐渐了解到肿瘤微环境的复杂性和多样性，以及它对免疫治疗的重要影响。肿瘤微环境与肿瘤细胞相互作用，共同介导了肿瘤的免疫耐受，从而影响了免疫治疗的效果。抗肿瘤免疫应答是由众多免疫细胞和分子参与的复杂过程，受到机体复杂而精细的调控，这其中的机制仍有待进一步研究。2017年6月，北京大学张泽民课题组及其合作在Cell杂志发表了肝癌T细胞图谱研究[10]，研究总共获得5063个单细胞的数据，总共聚类为11个T细胞亚群，包括 5个CD8+T细胞亚群和6个CD4+T细胞亚群。其中肝癌组织中侵润Tregs细胞亚群（C8_CD4-CTLA4 ）和耗竭性CD8 T细胞亚群（C4_CD8-LAYN）显著富集，并且在这两类细胞中表达的PDCD1和 TIGIT等，是免疫治疗的靶点。在肿瘤侵润性Tregs中，共鉴定出401个特异表达基因，在耗竭性CD8 T细胞中，鉴定出82个特异表达基因，并且发现了新的耗竭maker，如LAYN，PHLDA1和SNAP47等。值得注意的是，其中22个耗竭marker同时也在肿瘤侵润性Tregs细胞中高表达，例如CTLA4和LAYN等。并且利用TCGA的数据进行生存分析，发现LAYN的表达显著降低生存期。本研究还在单细胞水平进行了TCR测序和分析，结果发现，在肿瘤侵润的exhausted T细胞和Tregs细胞中，观察到TCRs发生了重复使用。在肿瘤组织中含有相同TCR的T细胞比例较高，而在外周血和正常组织中比例较低，这说明在肿瘤中的exhausted T细胞和Tregs细胞发生了克隆扩增。并且相比于早期病人，晚期病人中T细胞的克隆扩增更加明显。本研究为肿瘤免疫的图谱勾画做出了范式，也为今后其他肿瘤开展类似的研究及各类肿瘤免疫的发展提供基础。
肝癌患者的单细胞测序
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用药指导
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药物诱发的超敏综合症（DiHS/DRESS）是一种致命的多器官炎症性疾病，与疱疹病毒再激活和诱发的自身免疫性疾病相关。病理生理学仍然不清楚，临床治疗的选择有限。2020年1月发表在Nature Medicine上研究对DiHS/DRESS患者的皮肤和血液进行了scRNA-seq检测[11]。皮肤活检组织通过单细胞RNAseq发现，患者对比健康人差异表达基因数量最多的是淋巴细胞群体。分析皮肤活检的淋巴细胞，发现患者淋巴细胞呈现不同的分群。患者淋巴细胞中高表达的代表性基因有CCR10，JAK3，STAT1等。
患者皮肤活检的淋巴细胞呈现不同的分群
血液PBMCs细胞通过单细胞测序发现，患者对比健康人差异表达基因数量最多的是CD4和CD8阳性的亚型细胞和增殖的细胞。比较血液PBMCs在患者和健康人中的细胞群体分布，发现CCR4和CCR10（免疫细胞皮肤归巢趋化因子受体）高表达的CD4和CD8阳性细胞在患者中显著高于健康人。在患者的这个细胞群体中，表达JAK3，STAT1，IL2RG等基因的细胞比例明显高于健康人。
患者血液的CD4和CD8细胞呈现不同的分群
给予患者JAK抑制剂（tofacitinib）和口服抗疱疹病毒抑制剂（valganciclovir）后，患者的症状得到了极大的临床获益。治疗前后的血液PBMCs细胞再次经过单细胞RNAseq检测发现细胞群体分布明显分化。体外实验也证实JAK抑制剂（tofacitinib）和抗病毒药物（Ganciclovir和Artesunate）能够有效抑制药物（SMX-TMP）诱导的T细胞增殖。
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病毒感染
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2020年1月，整个中国因新型冠状病毒2019-nCov得了一场“感冒”。疫情一开始，武汉病毒研究所石正丽团队就用实验证实了血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是新型冠状病毒感染人体的受体基因。2020年1月26日，上海同济大学医学院左为研究团队在《bioRxiv》上发表了题为“Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov”的文章[12]。
该研究利用已有的数据库，结合单细胞RNA测序技术中相关生信分析，对ACE2在人肺内单个细胞的表达情况进行了分析，共涉及8个样本，43134个细胞。结果表明：ACE2受体主要在一部分（1%左右）II型肺泡上皮细胞（AT2）中表达；同时发现这些AT2细胞除了表达病毒受体，还表达与病毒复制和传播相关的基因，说明其很可能是冠状病毒的靶细胞。可见，单细胞测序技术不仅是科研的利器，同时还为破解疫情做了应有的贡献。
ACE2和其它marker基因在细胞亚群中的表达
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参考文献
[1] Ramskold D, Luo S, Wang YC, et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol 2012, 30(8):777-782.
[2] Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods 2013, 10(11):1096-8.
[3] Picelli S, Faridani OR, Björklund AK, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc 2014, 9(1):171-81.
[4] Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods 2009, 6(5):377-382.
[5] Yan L, Yang M, Guo H, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol 2013, 20(9):1131-1139.
[6] Cui Y, Zheng Y, Liu X, et al. Single-Cell Transcriptome Analysis Maps the Developmental Track of the Human Heart. Cell Rep 2019, 26(7):1934-1950.e5.
[7] Zhou F, Li X, Wang W, et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution. Nature 2016, 533(7604):487-92.
[8] Zhou J, Xu J, Zhang L, et al. Combined Single-Cell Profiling of lncRNAs and Functional Screening Reveals that H19 Is Pivotal for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development. Cell Stem Cell 2019, 24(2):285-298.e5.
[9] Li CL, Li KC, Wu D, et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Res 2015, 26(1):83-102.
[10] Zheng C, Zheng L, Yoo JK, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 2017, 169(7):1342-1356.
[11] Kim D, Kobayashi T, Voisin B, Jet al. Targeted therapy guided by single-cell transcriptomic analysis in drug-induced hypersensitivity syndrome: a case report. Nat Med 2020,26(2):236-243.
[12] Yu Zhao, Zixian Zhao, Yujia Wang, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv 2020.
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